Identificación de clones de interés

La identificación de los clones de interés entre cientos o miles de clones re-presenta un problema que demanda tiempo y que depende de la sensibilidad y especificidad del sistema de detección.

Muchos métodos utilizan sondas radiactivas de gran especificidad que contienen secuencias complementarias al ADN de interés.

La identificación puede hacerse obteniendo una réplica de las colonias en un filtro, las cuales son posteriormente lisadas, el ADN fijado al filtro, hibridizado con la sonda y detectado por autoradiografía.

En otros casos se puede utilizar un vector de expresión que posea un operón dentro del cual se inserta al ADN.

Si se dispone de un plásmido con un operón lactosa (lac) inducible, se puede insertar en fase el fragmento de ADN dentro del gen lac Z, obteniéndose así una proteína de fusión de la B=galactosidasa.

Si la proteína de interés a producir es tóxica para la célula, esto se supera empleando células que elaboren represores del operón lac.

Cuando la concentración celular del cultivo es elevada, se induce la expresión con isopropil-B-D-tiogalactopiranó-sido (IPTG), detectándose la presencia de la proteína de interés por métodos inmunológicos.

Finalmente para aumentar la estabilidad de la proteína a producir, a la cual contribuye la estructura de la B-galactosidasa, se usan huéspedes deficientes en proteasas.

Fuente: Apuntes de Microbiología Industrial del Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA