Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios
Metabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorganismo como por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos.
Antes de considerar la selección de este tipo de mutantes, es necesario conocer los mecanismos de control involucrados en la biosíntesis de estos metabolitos.
Las concentraciones de los mismos están reguladas por sistemas de control por retroalimentación («feed back»). Los dos principales sistemas involucrados son inhibición y represión «feed back».
En la inhibición, el producto final de una vía metabólica inhibe la actividad de una enzima (normalmente la primera) de su vía de formación, cuándo se ha sobrepasado un valor máximo de concentración intracelular de dicho producto (caso de biosíntesis de aminoácidos).
La primera enzima de la vía es de tipo «alostérica», lo que significa que en este caso el producto final se une a ella en el centro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamada inhibición competitiva), afectando la unión de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi instantáneo.
La represión es aquella donde el producto final de una vía metabólica previene la síntesis de una enzima o de todas las que catalizan la vía mencionada. Esto ocurre a nivel de ácido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripción del gen a ácido ribonucleico mensajero (ARNm).
Este mecanismo es de acción más lenta que el anterior, ya que permite actuar a las enzimas preformadas.
Los mecanismos de regulación son más complejos en caso de vías biocinéticas ramificadas donde los productos de cada brazo son raramente requeridos por el organismo en igual proporción. Los procesos de control de estos son los siguientes:
a) por isoenzimas;
b) concertado o multivalente;
c) cooperativo;
d) acumulativo;
e) secuencial.
Para un conocimiento detallado de estos mecanismos de control se remite al lector a la bibliografía.
Como se ve, la concentración de un metabolito microbiano es controlada por una variedad de mecanismos.
El conocimiento de la vía metabólica y su control facilita la construcción del mutante deseado.
Estos pueden tener distintas modificaciones:
a) el mutante no reconoce la presencia del inhibidor o represor;
b) no se produce producto final, que es el que controla la enzima clave de la vía metabólica;
c) el producto final es eliminado de la célula debido a una modificación en la permeabilidad de la membrana celular.
Los mutantes que no producen inhibidores o represores por producto final pueden ser empleados para la producción de intermediarios en caminos no ramificados, o de intermediarios y productos finales en caminos ramificados.
Al no producirse el producto final de la ruta, el control de la misma es eliminado, pero como estos productos son esenciales para el crecimiento, los mismos se deben incorporar al medio en concentraciones tales que permitan el desarrollo, pero que no ejerzan el control normal por inhibición o represión.
En este caso los mutantes son auxotróficos para uno o más productos finales. El aislamiento dé estos mutantes puede resultar en la obtención de un cepa altamente productora, si la mutación ocurre en el sitio correcto.
La selección de auxótrofos se puede realizar empleando técnicas de enriquecimiento o mediante la identificación visual de mutantes.
Por ejemplo, la separación mecánica de esporos auxótrofos y prototróficos de organismos filamentosos ha sido alcanzada por el método de «enriquecimiento por filtración».
Se ha aplicado a Aspergillus, Neurospora, etc. El procedimiento implica la incubación de una suspensión de esporos mutada, en un medio líquido mínimo; los protótrofos desarrollan en tanto que los auxótrofos no.
La suspensión es luego filtrada a través de un filtro adecuado, obteniéndose un filtrado enriquecido en auxótrofos, debido a que los esporos germinados por su mayor tamaño son retenidos en el filtro.
Si bien los mutantes auxotróficos se utilizan para producir grandes cantidades de muchas sustancias de interés, los mismos no son adecuados para la obtención de productos que controlan independientemente su síntesis. Un caso típico es el que figura a continuación, donde se sintetiza un producto P.
Las letras minúsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso. En este caso si P es el producto requerido, no es apropiado tener un auxótrofo.
La solución es modificar el organismo de tal forma que la primer enzima (a) no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El aislamiento de tales mutantes se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a metabolitos análogos y/o de revertantes.
Los metabolitos análogos (compuestos similares a otros en su estructura) han ampliado el rango de inhibidores para los cuales se obtienen mutantes resistentes.
En el ejemplo de la vía metabólica anteriormente presentado si P* es un análogo tóxico de P, un mutante puede ser aislado en presencia de P* si por ejemplo, la primera enzima de la vía no es suceptible a la inhibición por el análogo.
Esta enzima también podría ser resistente al efecto de control de P, por lo cual habría una producción no inhibida. Para el aislamiento de este tipo de mutantes se puede emplear la técnica de gradiente en placa, en la cual existe una variación en la concentración del análogo en un sentido de la placa, presentando la misma, zonas de escaso crecimiento por altos niveles del análogo tóxico desde donde es posible aislar los mutantes resistentes.
Estos deberán ser posteriormente estudia-dos en relación a la producción de P.
Otra posibilidad de mejorar los rendimientos de este tipo de productos es el empleo de revertantes. En este caso un mutante auxotrófico para P (no produce la enzima «a») es sometido a una segunda mutación con el objeto de obtener revertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima «a» producida no reconoce en control de P).
Mutantes resistentes a análogos de aminoácidos han sido empleados en procesos de mejoramiento de cepas, para la obtención de antibióticos.
El mejor ejemplo de mutantes modificados en la permeabilidad es el caso de la fermentación de ácido glutámico.
Se ha aislado un mutante de Corynebacterium glutamicum, cuya permeabilidad puede ser modificada por el nivel de biotina.
O sea la permeabilidad celular es controlada por la composición del medio de cultivo; de esta forma el organismo puede excretar glutamato (50 g l -1) con bajas concentraciones de biotina (5 ug l-1). Esto sugiere la posibilidad de modificar genéticamente la permeabilidad celular para incrementar la productividad.
Fuente: Apuntes de Microbiología Industrial del Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA.
