Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundarios
Metabolitos secundarios son sustancias no imprescindibles para las funciones vitales como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibióticos, giberelinas, etc.
La relación entre metabolito primario y secundario presenta todavía numerosos interrogantes con relación a los mecanismos que controlan la síntesis de estos últimos.
Se deben hacer algunas consideraciones, ya que en ciertas fermentaciones de antibióticos la velocidad de crecimiento regula la formación de enzimas biosintéticas.
En el caso de la gramicidina S (GS), las GS sintetasas se forman en la última parte de la fase de crecimiento exponencial.
Las enzimas después de alcanzar un pico en sus actividades específicas desaparecen rápidamente al entrar la población en fase estacionaria.
Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron establecer una relación inversa entre la velocidad específica de crecimiento y la producción de sintetasa.
Si bien el mecanismo no es conocido, se estableció que los picos de actividad específica en función de u varían de acuerdo a la naturaleza del sustrato limitante de crecimiento (C, N, S y P).
Otro factor del proceso de control es la regulación «feed back» lo que significa que la acumulación de metabolitos secundarios (penicilina, cloranfenicol, cicloheximida, cte.) es lo que limita su propia síntesis.
En el caso de caminos ramifica ATP con disminución dos como el de penicilina, la acumulación intracelular de lisina disminuye su producción, efecto que se revierte por el agregado de a-aminoadipato.
Algunos tipos de regulación «feed back» involucran a fosfato inorgánico, el cual regula la actividad de fosfatasas. En algunos casos la adición del fosfato al
medio de cultivo limitado se asocia con un incremento de de la formación de antibiótico.
Como ya se dijo, la glucosa y la fuente de nitrógeno (en especial amonio) si es rápidamente metabolizada ejerce represión catabólica. Un ejemplo es la producción de cafalosporinas por Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida por amonio.
Debido a que la producción de estos metabolitos es afectada por mecanismos de control genéticamente determinados, las mutaciones pueden tener efectos importantes en el mejoramiento de cepas.
Los programas iniciales en la industria de antibióticos inducían mutaciones sobre células o esporos mediante el empleo de agentes físicos y químicos.
Si uno repasa el caso típico de la penicilina en el cual las primeras cepas de Penicillum chrysogenum producían alrededor de 20 unidades ml -1 ,(20 U ml -1 ), se observa que las técnicas de mutación clásica han permitido obtener mutantes adecuados para la aplicación posterior de técnicas más recientes como la fusión de protoplastos y las de clonaje de genes.
Se pueden emplear dos técnicas de selección al azar, de mutantes obtenidos después de un tratamiento.
Los procedimientos en medios líquidos son en general largos y requieren gran cantidad de material. La ventaja es que el proceso es controlado en condiciones relativamente comparables a las de producción en relación a agitación y aeración.
El test en placas es más rápido, permite controlar un mayor número de colonias con menor material pero en condiciones que no reproducen la fermentación en medio líquido.
Se trata aquí de evaluar la cantidad de antibiótico excretado por una colonia. Una variante consiste en cubrir la placa con un celofán estéril y agregar sobre el mismo una capa de agar conteniendo el organismo indicador, incubando luego la placa toda la noche.
De esta forma, las colonias de los mutantes son mantenidas libres de contaminación por el organismo sensible. En este caso el tamaño de la zona de inhibición es controlado por el espesor de la capa. Evidentemente, como se mencionó anteriormente, el programa de mejora-miento debe incluir una mejora en el medio de producción.
Se observa, en general, en un programa de mejoramiento, que los saltos en la producción al inicio del programa son importantes, pero después la selección de mutantes superproductores se vuelve cada vez más difícil.
Con referencia a los estudios de «screening» en placas, un factor importante es la composición del medio sólido para lograr que la cepa pueda expresar toda su capacidad productora.
En algunos casos las condiciones de limitaciones de nutrientes, que favorecen el comienzo de la producción de antibióticos en medio líquido no son alcanzadas en medio sólido, sin embargo esto se puede corregir suprimiendo la principal fuente de carbono y reduciendo, por ejemplo, el contenido de agua de macerado de maíz, como en el caso de penicilina.
Es posible en base a la experiencia adquirida en el curso de los trabajos de mutagénesis-selección, establecer una correlación entre los caracteres fisiológico o bioquímicos y la producción del microorganismo.
En este sentido pueden aveces intervenir en la selección en medios sólidos criterios morfológicos, pigmentación de colonias, resistencia al antibiótico producido, etc.
Fuente: Apuntes de Microbiología Industrial del Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA.
