Vectores de clonado
Para la transferencia y expresión de un ADN «extraño» en una célula huésped, se requiere de un vector de expresión, el cual debe ser capaz de entrar y replicarse dentro de ella.
Un vector ideal debería ser pequeño, de fácil preparación y replicación en la célula huésped, no generar productos tóxicos para la misma, poseer uno o más marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar una rápida y positiva selección y contener al menos un sitio donde se pueda integrar el ADN extraño sin destruir una función esencial (replicación).
Los plásmidos son muy empleados como vectores. Son moléculas de ADN circular extracromosomal que se replican independientemente.
Los que poseen genes para resistencia a antibióticos son de gran utilidad debido a que su adquisición por bacterias «competentes» es fácil de detectar.
Uno de los más conocidos, el pBR322 posee sitios únicos de restricción y lleva genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina.
Estos genes poseen sitios de restricción para la inserción de fragmentos de ADN, resultando luego de esta inserción en una inactivación del gen. En este caso la bacteria que reciba este plásmido, adquirirá la resistencia especificada por el otro gen intacto.
Los plásmidos que presentan un gran número de copias por célula, son los más empleados como vectores, debido a que al amplificar muchas veces el número de segmentos del ADN de interés, permiten incrementar los rendimientos del producto del o los genes que transportan.
En una célula la información genética está presente en dos formas diferentes, el ADN genómico y el ácido ribonucleico mensajero (ARNm), que posee la parte codante del gen sin el promotor.
Estas dos formas pueden ser clonadas empleando dos estrategias distintas, donde el conjunto de colonias resultantes de la transformación representa la «biblioteca genómica» o «genoteca», de la cual habrá que extraer los clones de interés.
En el segundo caso a partir del ARNm se obtiene un ADN complementario (ADNc), para un ARN eucariótico. Este ADNc se puede insertar posteriormente en un plásmido u otro vector.
Células «competentes» mediante un tratamiento con una solución de CaCl 1061, C 600, DH 1, DH 5, IM.
En la formación de una genoteca para la expresión de genes de un organismo eucariótico, se debe tener en cuenta que en este caso el ADN genómico contiene secuencias que están ausentes en el ARN correspondiente.
Los genes eucarióticos están constituidos por secuencias o regiones que no aparecen en el ARNm, denominadas «in-trones» o «secuencias intervinientes» y por regiones presentes en el ARNm llamadas «exones».
El número y tamaño de los intrones varía de un gen a otro, pudiendo encontrarse genes que carecen de ellos.
En el proceso de transcripción, se obtiene un ARNm primario (localizado en el núcleo) que contiene tanto las secuencias de los exones como de los intrones, por éste sufre luego un proceso de «maduración» o modificaciones posttranscripcionales que involucran desde alteración química de bases individuales (metilaciones), adiciones al 5′ («caping») o 3′ del transcripto (poliadenilación), hasta la forma más grande de procesamiento que involucra la separación de los intrones («splicing»).
Como consecuencia de estas modificaciones y procesamiento se obtiene como producto un ARNm funcional que será traducido a nivel ribosomal.
Por lo tanto si se quiere obtener una proteína eucariótica en bacterias, es imprescindible obtener un ADNe al ARNm en cuestión, a partir del cual se llevará a cabo el donado.
Fuente: Apuntes de Microbiología Industrial del Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA
