Proceso de transformación por plásmidos
El proceso de transformación por plásmidos se caracteriza en general por ser de baja eficiencia; por lo tanto para incrementar la misma se deben tener en cuenta una serie de factores:
a) elección de una cepa huésped adecuada; en el caso de E. coli existen varias recomendadas (la mayoría de las cepas K12, MC 109, HB 101, etc);
b) etapa de crecimiento, ya que la frecuencia de transformación es mayor cuando el cultivo de E. coli está en la mitad tardía de la fase exponencial;
c) procedimiento de transformación empleado. En general existe un modelo lo que implica la obtención en un primer paso de 2 (50m M) en frío, luego de lo cual las células se ponen en contacto con la solución del plásmido purificado incubando en hielo de 10 a 60 competentes en una población tratada, oscila entre 0,01% y 10% de las células viables.
La frecuencia de la transformación o eficiencia se puede determinar empleando un ADN standard (como pBR322) y puede oscilar entre 1 x 106 a 1 x 108 unidades formadoras de colonias mg-1 de ADN.
Una aclaración especial es la referida a la calidad de las drogas a emplear (en general reactivos para biología molecular) y los cuidados del operador para no «contaminar» las soluciones.
Otros vectores del clonado incluyen a los faltos k, los cuales poseen un número de ventajas que los hacen atractivos para el clonado.
El cromosoma de este bacteriófago es una molécula de ADN lineal de 49 Kb de longitud, en el cual cerca del 40% no es esencial para su propagación.
Fragmentos de ADN extraño de hasta 24 Kb pueden ser propagados empleando este vector, ubicando estos fragmentos en la región central del genoma, la cual contiene genes no esenciales.
El reemplazo de estos es fundamental debido a que sólo genomas de 40-52 Kb pueden ser empaquetados dentro de las partículas del fago con alta eficiencia. Si sólo se ligan los dos extremos o brazos, la molécula de ADN obtenida es muy pequeña para ser empaquetada.
La molécula de ADN recombinante del fago puede ser introducida como tal en la célula bacteriana (transfección) con una eficiencia de 10 1 clones recombinantes ug-1 ADN o puede superar a 10 6 clones u g-1 si se realiza por infección, empaquetando previamente in vitro al DNA recombinante.
Si el objetivo es clonar grandes fragmentos de ADN pueden emplearse como vectores los cósmidos, que son elementos genéticos equivalentes a plásmidos de gran tamaño y encapsulados dentro de la cabeza de un fago para ser introducidos en las células.
En los cósmidos se pueden introducir fragmentos de hasta 45 Kb, lo cual reduce el número de clones a obtener para disponer de una genoteca representativa.
Como llevan el origen de replicación de un plásmido, se replican como tal dentro de la célula. Su desventaja es que por su gran tamaño, su número de copias (como plásmido) en la célula es reducido.
Fuente: Apuntes de Microbiología Industrial del Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA
